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  • 详细解析鬼笔环肽在行业中的操作步骤
  • 点击次数:141 发布时间:2019-09-24
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  •    鬼笔环肽是从一种剧毒磨菇中分离出来的一种多肽物质,属于毒伞肽类毒素,是一种强烈毒素。C35H48N8O11S。无色,细针状结晶。分子量788.87g/mol, 熔点281oC.
     
      鬼笔环肽的操作步骤:
      1、工作液准备:
      本品以溶于甲醇的20μM储存液形式提供,总量为300μl。按照100nM的工作液浓度来换算,可制备总量为60ml的工作液。建议收到产品后,根据单次使用量,对母液进行小量分装,-20℃避光冻存,一年稳定。开始实验前,使用1×PBS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为:80~200nM。现配现用。
     
      2、染色步骤:
      a、细胞爬片生长24h,使其密度达到50%汇合度。
      b、吸掉培养液,37℃预热的1×PBS(pH7.4)清洗细胞2次。
      c、使用溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定,室温固定10min。
      d、室温条件下,用PBS清洗细胞2~3次,每次10min。
      e、室温条件下,用丙酮(≤-20℃)脱水或者用0.5%TritonX-100溶液透化处理5min。
      f、室温条件下,用PBS清洗细胞2~3次,每次10min。
      g、取200μl配制好的FITC标记鬼笔环肽工作液,覆盖住盖玻片上的细胞,室温避光孵育30min(通常情况下,4℃~37℃孵育皆可)。
      h、用PBS清洗盖玻片3次,每次5min。
      i、使用200μlDAPI溶液(浓度:100nM)对细胞核进行复染,约30s。
      j、用PBS清洗盖玻片,然后倒置在已经滴有一滴Fluoromount-GTM水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂,然后用指甲油封片。此法制备的标本玻片可置于4℃避光保存,通常6个月内可继续做F-actin染色分析。
      k、荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察,选择FITC激发/发射滤片(Ex/Em=496/516nm)和DAPI激发/发射滤片(Ex/Em=364/454nm)。
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